验证试验结果分享：复合霉菌毒素吸附剂可有效减轻AFB1、DON和OTA对肉种鸡生产性能、肝脏和输卵管健康的联合毒性
市场部 张波
据报道，全球每年大约有25%的农产品会受到霉菌毒素的污染。霉菌毒素污染是一个全球性问题，长期流行病学调查发现，全球大部分粮食作物至少受到一种霉菌毒素污染，每年损失的粮食高达10 亿吨并造成9.32 亿美元的经济损失。
多年来，泰高赛尔可饲料安全项目一致致力于霉菌毒素的研究。近期，泰高FA验证团队与武汉华中农业大学孙教授合作，共同研究霉菌毒素吸附剂TOXO-XL 在种鸡上缓解AFB1、DON 和OTA其联合毒性的作用，试验主要发现已在国际期刊《Food and Chemical Toxicology》上发表。现将文章原文进行整理，与读者共享。
复合霉菌毒素吸附剂可有效减轻AFB1、DON和OTA对肉种鸡生产性能、肝脏和输卵管健康的联合毒性
- 摘要
本试验旨在评价复合霉菌毒素缓解剂对降低饲粮中黄曲霉毒素B1 (AFB1)、呕吐毒素(DON)和赭曲霉毒素A (OTA)对肉种鸡的不良影响的效果。选取360只30周龄哈伯德利丰(Hubbard Efficiency Plus)品系肉用种鸡，随机分为4组，分别饲喂基础日粮(BD;对照组)，BD加0.15 mg/kg AFB1+1.5 mg/kg DON+0.12 mg/kg OTA(毒素)，BD加毒素+0.1% TOXO-XL (毒素+XL1)， BD加毒素+0.2% TOXO-XL(毒素+XL2)，连续8周，然后再接受相同的基础日粮 4周。与对照组相比，霉菌菌毒素降低了1-8周和(或)9-12周的总蛋重、产蛋率、种蛋合格率、总蛋孵化率和蛋品质，但提高了料蛋比和死亡率，损害了肝脏和输卵管健康；提高肝脏和/或输卵管中PC和MDA浓度、细胞凋亡阳性细胞及IL-1β和IL-6的表达，降低T-AOC、GPX和CAT的活性。值得注意的是，两种剂量的TOXO-XL都减轻了这些负面变化。总体而言，0.2%的TOXO-XL比0.1%的TOXO-XL效果更好。综上所述，TOXO-XL可通过调节氧化还原、免疫和细胞凋亡，减轻霉菌毒素对肉种鸡生产性能、肝脏和输卵管健康的影响。
- 前言
霉菌毒素是霉菌孢子在菌丝生长过程中产生的有毒次级代谢物，可在玉米、大豆、小麦、花生等饲料作物生长期间及副产品的加工、运输、储存等过程中产生（Zhao et al 2021，Liu et al 2023，Wang et al 2023）。目前，已在近100 种真菌菌株中鉴定出大约500 种霉菌毒素，主要由五种霉菌属组成：曲霉属、镰刀菌属、青霉菌属、链格孢属和麦角菌属（Tsiouris et al 2021）。据报道，全球每年大约有25%的农产品会受到霉菌毒素的污染。霉菌毒素污染是一个全球性问题，长期流行病学调查发现，全球大部分粮食作物至少受到一种霉菌毒素污染，每年损失的粮食高达10 亿吨并造成9.32 亿美元的经济损失。（Pinotti et al 2016，Smith et al 2016，Eskola et al 2020，Pinto et al 2022）。当动物采食霉菌毒素污染饲料后会引起毒性反应，对动物的生产力和健康产生不利影响。黄曲霉毒素B1 （ Aflatoxin B1 ， AFB1 ） 、呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）和赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是饲料及原料检出率较高且危害巨大的几种霉菌毒素（Zhao et al 2021）。有研究报道，饲料AFB1、DON 和OTA 单独或联合污染率为74.5%-100%（Wu et al 2016，Ma et al 2018，Zhao et al 2021）。当饲料中三种霉菌毒素共存时，毒素间的相互作用会对动物造成更大的负面影响（Tsiouris et al 2021）。肉种鸡是畜禽业的重要组成部分，每年为满足消费者庞大的鸡肉需求提供了数百万只雏鸡（McKenna et al 2020）。因此，防控霉菌毒素污染对畜禽业的健康发展必不可少。
在饲料中添加脱毒剂是近年来畜禽生产应用较广的防霉方法。一般来说，理想的霉菌毒素脱毒剂应具有以下特性，包括对各种霉菌毒素（特别是那些具有低疏水性的霉菌毒素）的高吸附能力、与营养物质的低程度非特异性结合以及高安全性、稳定性和适口性等（Li et al 2018）。由于动物胃肠道复杂的微环境，脱毒剂吸附效率会受到极大影响，因此需要补充其他功能成分以最大限度减少霉菌毒素对动物的毒性作用。TOXO-XL 是一种复合霉菌毒素吸附剂产品，主要由膨润土和无活性酵母细胞壁（β-1, 3/1, 6-葡聚糖）构成，通过三种作用模式控制霉菌毒素，包括结合霉菌毒素以降低生物利用度、肠道保护和改善免疫系统功能。因此，本研究旨在评估复合霉菌毒素吸附剂TOXO-XL 缓解AFB1、DON 和OTA 对肉种鸡联合毒性的作用效果。
- 试验材料和方法
1 试验动物及试验设计
360只30周龄肉种鸡随机分为4个处理，每个处理组10个重复，每个重复9只鸡。4个处理组分别为对照组（BD组，基础日粮组），毒素组（BD+0.15 mg/kg AFB1 + 1.5 mg/kg DON + 0.12 mg/kg OTA），毒素组+TOXO XL1（0.1%脱霉素-XL），毒素组+TOXO XL2（0.2%脱霉素-XL），饲喂期8周，然后4个处理组饲喂对照组日粮4周。霉菌毒素剂量的选择是基于以前的报告，该报告显示，鸡日粮中摄入AFB1、DON和OTA会对母鸡产生负面影响 (Zhao et al., 2021a,b)。同样，根据家禽饲料中霉菌毒素吸附剂的常规剂量确定TOXO-XL的添加量，这也与霉菌毒素制造商的说明一致(Awad et al., 2014; Vasiljevi´c et al., 2021; Zhao et al., 2021a,b)。整个试验期鸡只限饲162 克/天、自由饮水。AFB1, DON和OTA分别由Aspergillus flavus NRRL-3357，Fusarium gramin-earum W3008和Aspergillus ochraceus AS3.3876制备获得。
2 测试参数
- 每日记录产蛋数、蛋重、采食量及死亡率。
- 在第4周，第8周及第12周的最后一天收集所有鸡蛋，用于蛋品质分析。
- 在第4周，第8周及第12周，每周连续5天收集鸡蛋，合格种蛋用于孵化。
- 试验结束，每个处理组随机取10只种鸡，屠宰取血液、肝脏、肾脏以及输卵管等样品，用于血清学分析及组织学检查。
3 数理统计
试验数据使用SPSS 13.0 统计软件进行分析，试验结果用“均值±标准差”表示，多均值比较采用Tukey-Kramer 法，产蛋性能和孵化性能结果的显著性为p < 0.1 认为有统计学意义，其余结果显著性为p < 0.05 认为有统计学意义。
- 结果
1 产蛋性能、蛋品质及孵化性能
产蛋性能结果见表1。与对照组相比，在第1-4周和第5-8周，饲粮中添加霉菌毒素显著降低了总蛋重5.7 ~ 8.6% (P < 0.10)、蛋重6.0 ~ 8.4% (P < 0.10)、产蛋率6.7 ~ 8.7% (P < 0.10)，料蛋比提高了6.9 ~ 10.6% (P < 0.10)。与对照组相比，霉菌毒素还增加了5-8周肉种鸡的死亡率，降低了9-12周的产蛋率。在不同的试验期，两种剂量的TOXO-XL均减轻了毒素部分负面影响(P < 0.10)。
表1. 饲粮中添加霉菌毒素和TOXO-XL对肉种鸡产蛋性能的影响
数值表示均值±标准差，n = 10。同行肩标字母不同表示差异显著，P < 0.10。对照组：基础日粮（BD）；毒素组：BD+0.15 mg/kg AFB1+1.5 mg/kg DON+0.12 mg/kg OTA（Toxins）；毒素+XL1 组：Toxins+0.1%TOXO-XL；毒素+XL2 组：Toxins+0.2% TOXO-XL。
蛋品质的结果见表2。与对照组相比，第4周时，饲粮中添加霉菌毒素可使蛋白高度降低14.9% (P < 0.05)，哈夫单位降低8.8%，蛋壳强度降低10.2%，蛋壳厚度降低6.7%。与霉菌毒素组相比，毒素+TOXO XL2组第4周蛋白高度提高18.0% (P < 0.05)，哈夫单位提高19.6% (P < 0.05)。在第8周，添加两种剂量的TOXO-XL使蛋黄颜色降低了3.1-7.2% (P < 0.05)。第12周各组蛋品质无显著差异(P > 0.05)。
表2. 饲粮霉菌毒素和 TOXO-XL 对肉种鸡蛋品质的影响
注：数值表示均值±标准差，n = 10。同行肩标字母不同表示差异显著，P < 0.05。
孵化性能结果见表3。与对照组相比，饲粮中添加霉菌毒素对第4周的孵化性能没有影响(P > 0.1)，但使第8周种蛋合格率降低了5.6% (P < 0.1)，入孵蛋孵化率降低了11.1% (P < 0.1)。此外，霉菌毒素组在第12周入孵蛋孵化率降低了10.0%，这表明前8周的性能下降不能通过再饲喂4周的基础饲料来逆转。与霉菌毒素组相比，TOXO-XL2对入孵蛋孵化率都有数值上的改善，在整个实验过程中，0.2%的TOXO-XL结果更好。
表3. 饲粮霉菌毒素和 TOXO-XL 对肉种鸡孵化性能的影响
注：数值表示均值±标准差，n = 10。同行肩标字母不同表示差异显著，P < 0.10。种蛋合格率 = (只有一个蛋黄、形状正常、壳完好的鸡蛋数/鸡蛋总数) *100; 受精率 = (受精蛋的数量/入孵蛋数量) *100; 死胚率 = (死胚数量/入孵蛋数量) *100; 受精蛋孵化率 = (出雏数/受精蛋数) *100; 入孵蛋孵化率 = (出雏数/入孵蛋数) *100.
2 器官指数，组织形态及细胞凋亡
脏器指数见图1A。与对照组相比，在第8周和第12周，饲粮中添加霉菌毒素使输卵管相对重量降低了13.2% ~ 22.3%（P < 0.05）。第12周时，霉菌毒素使肝脏和脾脏的相对重量分别增加了28.6%和19.5% (P < 0.05)。毒素+0.2% TOXO XL组减轻了霉菌毒素引起的所有这些变化，而毒素+0.1% TOXO XL组仅阻止了第12周肝脏指数的变化(P < 0.05)。
组织形态见图1B。与对照组相比，在饲粮中添加霉菌毒素可引起肝脏多灶性炎症、离散空泡变性、肝细胞脂肪变性和部分肝细胞坏死。与对照组相比，霉菌毒素组输卵管内柱状细胞排列不规则，绒毛脱落，细胞空泡化，淋巴细胞浸润明显。一般来说，两个剂量的TOXO-XL减轻了肝脏和输卵管霉菌毒素引起的大部分组织病理学改变。此外，TUNEL染色显示，饲粮暴露于霉菌毒素显著增加了肉种鸡肝脏和输卵管中TUNEL阳性细胞，而添加TOXO XL则显著降低了TUNEL阳性细胞（图2C ）。
3 血清生化指标
血清生化指标结果见表4。与对照组相比，饲粮中添加霉菌毒素使种鸡血清白蛋白浓度提高了16.0% (P < 0.05)。饲粮中添加0.2% TOXO-XL可抑制霉菌毒素诱导的血清ALB、IgG和IgM的变化(P < 0.05)，而添加0.1% TOXO-XL仅能抑制血清IgM的变化(P < 0.05)。
表4. 饲粮霉菌毒素和 TOXO-XL 对肉种鸡血清生化参数的影响
注：数值表示均值±标准差，n = 10。同行肩标字母不同表示差异显著，P < 0.05。
4 肝脏和输卵管中的氧化还原状态
氧化还原状态结果见表5。与对照组相比，饲粮中添加霉菌毒素提高了肝脏和输卵管中PC浓度(50.8 ~ 87.5%)，降低了CAT活性(33.3 ~ 38.9%)(P < 0.05)。同时，霉菌毒素降低了肝脏T-AOC(12.2%)、GPX(19.8%)活性，提高了输卵管MDA(62.1%)浓度(P < 0.05)。日粮中添加0.2% TOXO-XL可减轻所有这些不良反应。有趣的是，与霉菌毒素组相比，TOXO-XL和TOXO-XL均显著提高了输卵管中SOD和GPX的活性，毒素+0.2% TOXO XL处理组也显著提高了输卵管中T-AOC (P < 0.05)。
表5. 饲粮霉菌毒素和 TOXO-XL 对肉种鸡血清生化参数的影响
注：数值表示均值±标准差，n = 10。同行肩标字母不同表示差异显著，P < 0.05。
5 炎症因子相关基因的表达
炎症因子基因在肝脏和输卵管中的相对表达见图2。与对照组相比，饲粮中添加霉菌毒素增加了肝脏中IL-1β和IL-6的表达(P < 0.05)(图2A)。与霉菌毒素组相比，饲粮中添加0.2% TOXO-XL降低了霉菌毒素诱导的肝脏中IFN-γ、IL-6表达和输卵管中TNF-α、IL-2表达的变化(P < 0.05)(图2A, B)。值得注意的是，毒素+XL1组仅降低了肝脏中IL-6的表达(P < 0.05)。
图1. 霉菌毒素和TOXO-XL对肝脏和输卵管脏器指数(A-B)、组织病理学(C)和凋亡(D)的影响。数值为平均值±SD, n = 10。组间不同字母表示差异显著，P < 0.05。肝、输卵管切片组织病理学及TUNEL染色(100×放大)。对照组:基础日粮;毒素组:基础饲粮中添加0.15 mg/kg AFB1 + 1.5 mg/kg DON +0.12 mg/kg OTA;毒素+ XL1，基础日粮添加0.15 mg/kg AFB1+ 1.5 mg/kg DON +0.12 mg/kg OTA + 0.1% TOXO XL;毒素+ XL2，基础饲粮中添加0.15 mg/kg AFB1 + 1.5 mg/kg AFB1kg DON +0.12 mg/kg OTA + 0.2% TOXO XL; AFB1，黄曲霉毒素B1; DON, 呕吐毒素; OTA，赭曲霉毒素A。
图2. 饲粮霉菌毒素和TOXO-XL对肝(A)和输卵管炎症因子基因TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-2, IL-6和IL-10表达的影响 (B)。数值为平均值±SD, n = 8-10。组间不同字母表示差异显著，P < 0.05。
- 讨论
本研究表明，0.1%和0.2%的TOXO-XL能在一定程度上有效抵消AFB1、DON和OTA导致的对肉种鸡的不良影响，其中0.2%的TOXO-XL霉菌毒素吸附剂的缓解效果更好。根据以往的研究，本研究表明， AFB1、DON和OTA单独或联合污染饲料，会导致总蛋重、蛋重和产蛋率降低，同时在不同的试验期间增加料蛋比和死亡率(Ul-Hassan et al.， 2012;Wickramasuriya et al.， 2020)。同时，霉菌毒素降低了蛋壳强度和蛋壳厚度，这可能与钙、锌、维生素A、E和D3代谢受损有关(Devegowda and Ravikiran., 2008; Zhao et al., 2021)。霉菌毒素还降低了鸡蛋的蛋白高度和哈氏单位等内在品质特征；而一些报告显示，霉菌毒素在整个试验过程中并不影响这些特征 (Denli et al., 2008; Zhao et al., 2016)。这种差异可能是由于动物种类、年龄、试验持续时间和霉菌毒素剂量的差异 (Jia et al., 2016; Zhao et al., 2021)。值得一提的是，在第9-12周，对照组和霉菌毒素组之间的总蛋重和蛋质量没有差异。
由此可见，饲粮中霉菌毒素的减少可部分恢复肉种鸡的生产性能 (Yuan et al., 2022)。同时，霉菌毒素在不同的试验阶段降低了蛋的孵化性能，包括种蛋合格率和总孵化率，进一步证实了前人的研究结果 (Yegani et al., 2006; Zhu et al., 2023)。不难推测，这可能与种蛋质量下降有关。总体而言，两种剂量的TOXO-XL均能成功缓解霉菌毒素对肉鸡的大部分不良影响。
这些结果与先前的研究一致，即膨润土或酵母产品可以减轻霉菌毒素对畜禽生产性能的不利影响 (Yegani et al., 2006; Bzducha-Wróbel et al., 2019; Stefanović et al., 2023)。
本研究进一步表明，霉菌毒素引起的肉鸡种母鸡生产性能低下与几个器官的损伤有关 (Lee et al., 2012)。与对照组相比，饲粮中添加霉菌毒素降低了输卵管的相对重量，但增加了肝脏和脾脏的相对重量。输卵管受损正好说明产蛋率下降，而TOXO-XL的加入消除了由于联合霉菌毒素引起的负面影响，防止了输卵管的萎缩 (Lv et al., 2019; Saberifar et al., 2021)。由于真菌毒素的代谢和积累主要发生在肝脏，肝脏是其发挥毒性作用的主要靶器官 (Hasuda et al., 2022)。同时，多种真菌霉菌毒素联合使用对动物具有生殖毒性 (Huo et al., 2020; Raj et al., 2023)。而组织病理学检查显示，霉菌毒素对肉鸡种鸡肝脏和输卵管有明显的损伤，这与Zhai翟等、杨等前期研究结果一致 (Yang et al., 2020; Zhai et al., 2020)。有趣的是，在饲粮中添加两种剂量的TOXO-XL都能减轻霉菌毒素对肉鸡种鸡肝脏和输卵管组织病理学变化的负面影响。
血清生化结果显示，真菌毒素暴露使白蛋白浓度升高。白蛋白与肝肾功能相关，霉菌毒素引起的白蛋白升高反映了肝脏和肾脏的损害 (Singh et al., 2019; Csenki et al., 2023)。与霉菌毒素组相比，0.2% TOXO-XL降低血清中IgG和IgM的浓度，而与对照组相比无差异。这表明霉菌毒素刺激了肉种鸡的免疫系统，导致这些物质的代偿性增加，0.2%的TOXO-XL缓解了这些炎症反应 (Awad et al., 2013)。
本研究对肝脏和输卵管的氧化还原状态进行了研究。PC和MDA分别是反映蛋白质和脂质过氧化程度的重要指标(Ayala et al., 2014；Hauck et al., 2019)。T-AOC、SOD、GPX和CAT组成了催化这些超氧化物和过氧化物的重要抗氧化系统 (Wang et al., 2020; Chen et al., 2022)。与既往研究一致，暴露于霉菌毒素后，肉鸡肝脏和输卵管中MDA和PC浓度升高，T-AOC、CAT和GPX活性降低，表明肉鸡受到氧化应激的影响 (Awad et al., 2014; Zhang et al., 2023)。上述结果共同证实，畜禽暴露于受AFB1、DON和OTA污染的饲料中，无论是单独暴露还是联合暴露，都会对肉种鸡的肝脏和输卵管造成损害 (Luo et al., 2019; Zhang et al., 2020)。有趣的是，添加0.2% TOXO-XL可以缓解大部分器官指数和氧化还原状态的负面变化。这些结果也验证了膨润土、酵母细胞壁和(或)β-1,3/1,6-葡聚糖可以减轻多种霉菌毒素引起的动物不良反应，霉菌毒素吸附剂的浓度应引起重视 (Ghazalah et al., 2021; Zhao et al., 2021; Liu et al., 2022)。
在本研究中，饲粮暴露于真菌毒素可增加肉种鸡肝脏和输卵管中tunel阳性细胞的数量，这反映了肉种鸡肝脏和输卵管中DNA断裂和细胞凋亡 (Liu et al., 2020; Mo et al., 2023), 而两种剂量的TOXO-XL均能减轻细胞凋亡。霉菌毒素还增加了炎症细胞因子基因IL-1β和IL-6在肝脏中的表达，但不影响其在输卵管中的表达，这可能是由于霉菌毒素的代谢和积累主要发生在肝脏，霉菌毒素在肝脏中发挥其毒性作用。这些发现与先前的研究一致，即动物单独或联合食用被AFB1、DON和OTA污染的饲料，可诱发肝脏和输卵管炎症，降低生产性能 (Yang et al., 2020; Zhai et al., 2020)。在饲粮中添加两种剂量的TOXO-XL均可降低霉菌毒素诱导的炎症相关基因的上调，这表明TOXO-XL可以帮助肉种鸡应对炎症反应，从而改善动物的免疫状态。
- 结论
AFB1、DON和OTA联合污染饲粮导致肉种鸡生产性能不佳。此外，饲粮霉菌毒素引起的不良反应似乎与肝脏和输卵管的损害、氧化还原状态的不平衡以及引发的炎症反应有关。本研究发现，饲粮中添加0.1%和0.2%的TOXO-XL均能有效解毒，其中0.2%的TOXO-XL在大多数参数上效果更好。综上所示，TOXO-XL在肉鸡养殖生产中具有良好的应用前景。
参考文献略 | 文章来源：Food and Chemical Toxicology 182 (2023) 114159
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